青霉素是最早应用于临床的抗生素，由于具有杀菌能力强、毒性低、价格低，被临床大量使用。

青霉素除了其钾盐大量静注易引起高钾血症、肌肉注射疼痛外，最常见的副作用为过敏反应，主要症状可分为过敏性休克、药物引起的皮肤皮疹瘙痒红肿、溶血性贫血粒细胞减少症以及血清病型反应等过敏反应。

发生青霉素过敏主要是因为在厂家生产过程中或运输储存过程中产生的中间产物，包括青霉噻唑蛋白、青霉烯酸等青霉素的降解产物以及6-APA高分子聚合物。这些都可以是过敏反应的致敏原。所以在临床上，为了防止青霉素发生严重的过敏性休克等副作用，一般在使用青霉素注射剂或口服的阿莫西林时都要进行皮试实验。并且在进行青霉素皮试时，还要做好急救的准备。常须备好抗过敏性休克药物，肾上腺素和糖皮质激素。但是在临床上还是出现了青霉素皮试实验阴性后，使用青霉素类药物出现了过敏性休克的例子。所以在进行皮试是，应该也要使用同一批号的青霉素。而不管口服阿莫西林胶囊还是注射用青霉素都需要进行皮试，这大大限制了青霉素类药物的使用。注射给药需要皮试就算了，口服给药还要皮试，总感觉没有体现出口服给药当然优势，还不如注射给药。

此外青霉素在治疗梅毒或钩端螺旋体时可能会发生症状加重的现象(也称为赫氏反应)。

一般发生在青霉素开始治疗后的6小时，表现为全身不适、寒战、发热、咽痛、心跳加快等。同时存在疾病加重的现象，甚至威胁生命。此反应可能是因为螺旋体抗原与相应抗体形成免疫复合物的结果造成的，或与螺旋体释放内毒素致热原有关。

最后肌内注射局部可发生周围性神经炎，鞘内注射和全身大剂量应用可引起青霉素脑痛。大剂量静脉注射给药，需监测血清离子浓度，防止发生高钠血症、高钾血症。